生物药物包括单抗、重组蛋白、病毒载体等通常都是通过细胞表达产生,经过纯化、除菌过滤、制剂工艺后获得。在工艺过程中会产生包括微生物污染、热原、细胞成分、培养基中的成分等外来杂质,这些杂质会影响最终药品的安全性和有效性,在开发过程中对杂质的鉴别、定量、定性和控制是非常重要的。

1)内毒素

内毒素是革兰氏阴性细菌细胞壁中的一种成分,叫做脂多糖,由细菌死亡自溶时释出,又称之为“热原”,进入人体内会引起急性炎症反应。

目前对于内毒素的检测主要分为基于传统的鲎采血的LAL/TAL法和出于对鲎资源的保护,新兴的基于重组 C 因子的内毒素检测方法。LAL/TAL法是从栖生于海洋的节肢动物“鲎”的蓝色血液中提取变形细胞溶解物制作而成,LAL试剂来自于美洲鲎,TAL试剂来自于东方鲎。LAL/TAL法一般通过多个酶促级联凝固,以凝胶法、比浊法或显色法定量。LAL/TAL法简单﹑快速﹑灵敏﹑准确,因而被欧美药典及我国药典定为法定内毒素检查法,并已被世界各国所采用。

重组C因子法是利用重组技术合成的内毒素特异性酶,被活化后可直接与荧光底物作用产生与内毒素浓度成比例的荧光信号,从而实现定量。由于内毒素检测的需求持续上升,而鲎资源却在急剧紧缩。因此,重组C因子法目前已被世界主流药典认同。

丹纳赫生命科学旗下美谷分子的多功能酶标仪可用于LAL法和重组 C 因子法的多种内毒素试剂盒检测。

特别是SpectraMax i3x多功能酶标仪具有光吸收、荧光、化学发光和FRET检测功能,兼容客户端模块化升级功能,可以根据需要任何时间随意升级至荧光偏振FP、HTRF、AlphaScreen、Western Blot、细胞成像和带有注射器模式下的快速动力学检测等,还可进行ELISA宿主细胞残留蛋白,牛源污染物(如BSA,IgG,胰岛素,铁传递蛋白),蛋白A和G等杂质的检测。

2)宿主细胞蛋白(host cell protein, HCP)

宿主细胞蛋白是指生物药中来自生产细胞系的宿主细胞的蛋白成分,主要包括宿主细胞分泌的蛋白以及细胞凋亡、代谢产生的部分结构蛋白。作为生物药生产过程中的残留杂质,HCP是具有多种生理化学和免疫学特性的复杂混合物,可能在人体内引发免疫反应,如:发热、水肿,甚至休克等,人体的免疫应答性质和效果,会受到HCP的浓度、数量和个体免疫系统差异影响而不同,此外,某些HCP还可以充当佐剂来增强生物药物产品的免疫反应。因此,建立合适的HCP残留量检测方法将有助于监测生产工艺,确保生物药的质量和安全。

国际人用药品注册技术协调会(ICH)、美国食品和药物管理局 (U.S. FDA)、欧洲药品管理局 (EMA) 和其他国家的监管机构都有关于 HCP 监测的指南,普遍认为,需要采用敏感且经过验证的有效方法来监控残留的HCP,通常为1至100ng/ml。

典型的单抗不同纯化阶段HCP浓度变化情况

MABS 2017, VOL. 9, NO. 4, 654–663

在对工艺中HCP的监控和产品放行中,双抗夹心酶联免疫法(ELISA)一直被用作HCP检测的金标准。这主要是因为ELISA可以在mg/ml级别的产品蛋白中有效地检测ng/ml级别的HCP残留,并且ELISA方法成熟,可操作性强,是经典的免疫学检测方法。

HCP ELISA的原理是先将HCP抗体包被酶标板,孵育待测样品,通过HCP抗体捕获和富集样品中HCP,再加入与包被酶标板的抗体种属不同的,酶联报告基团的HCP抗体,结合已被富集的HCP,通过底物显色或荧光的方式,最终定量计算HCP。

丹纳赫生命科学旗下美谷分子的酶标仪同样适用于各种HCP的ELISA检测实验。

SpectraMax i3x多功能酶标仪

由于需要检测HCP的工艺步骤多,ELISA的操作流程繁多,有大量的移液、清洗步骤,靠人工操作,难免会出现移液体积不准、漏加等人工操作误差导致的信号弱或者过饱和,以及标准曲线线性不佳、污染等问题。贝克曼库尔特拥有自动化工作站结合酶标仪的整合方案,可以自动化地对样本进行高通量的ELISA操作,最大程度避免实验误差及重复的人工劳动。

自动化工作站进行ELISA实验流程

自动化工作站进行ELISA实验的结果

但ELISA检测HCP不能从结果中得知样品中有哪些HCP,或者用于ELISA检测的抗体与哪些HCP发生了免疫反应,而且HCP的组成与丰度在生产的各个阶段与最终产品都各自不同,因此需要采用正交方法进行相互验证,互为补充。LC/MS方法可对生物治疗性蛋白质样品中的HCP进行鉴定和定量。

有文献采用SCIEX 的高分辨质谱仪结合高效液相色谱仪,开发了基于一维UHPLC-MS检测HCP的方法。在上游细胞上清液收获阶段,采用数据依赖性采集模式进行较高浓度的HCP检测,可以鉴定到上千个蛋白,建立数据库,同时可以得到HCP特异性肽段的离子对信息,在下游纯化阶段对较低浓度的HCP采用数据非依赖型SWATH的采集模式,可以获得低浓度HCP的定量信息,同时还可以根据HCP的特异性肽段的离子对信息,追踪特异性HCP在不同纯化阶段的浓度变化情况。

1D UHPLC-MS HCP检测流程

MABS 2017, VOL. 9, NO. 4, 654–663

Triple TOF 系列高分辨质谱系统 X500 系列高分辨质谱

该方法不但能对未知HCP进行鉴定,还能同时进行多种HCP的检测,通量可达20个样本/天,采用48种已知道蛋白作为标准品进行灵敏度定量测试,检出限可达7.56-0.5ppm。

HCP LC-MS与ELISA结合使用,可降低HCP监督的风险并提供有关HCP特性的有价值信息,以指导下游工艺的开发。

3)宿主细胞残留DNA

宿主细胞残留DNA(HCD)是一种可能存在于终产品中的工艺相关杂质,存在制瘤性和感染性的风险。现有研究表明,可能引发致病的功能基因至少在200 bp以上,因此残留DNA片段越大,风险等级越高。美国食品药品监督管理局(FDA)关于人类基因治疗新产品生产指导文件中明确指出HCD的片段要小于200 bp;国家药品监督管理局NMPA)生物制品药学部同样在《基因治疗产品药学研究与评价技术指导原则》的征求意见稿中指出,HCD的片段要小于200 bp。因此基因治疗终产品中需要合适的方法检测HCD的片段大小分布情况。

SCIEX的毛细管电泳PA 800 Plus制药分析系统采用凝胶电泳激光诱导荧光的检测方式,可对宿主细胞残留DNA的片段进行高灵敏的检测。使用SCIEX eCAP? dsDNA 1000 试剂盒可分离50-1000 bp范围的DNA片段,定量限低至10 pg/mL。若在前处理的过程中对DNA进行浓缩处理,可获得更高的检测灵敏度,满足各种残留DNA片段分布检测的需求。

PA 800 Plus对慢病毒载体中的HCD进行检测

4)不溶性微粒

注射剂药物在生产、运输或使用过程中,因为各种原因造成空气颗粒污染及玻璃瓶掉渣,甚至因为稳定性差导致药物颗粒发生团聚析出。有大量的研究报道,不溶性微粒注射到人体后会产生产生各种危害,包括:血管栓塞静脉炎、免疫原性反应等,为此各国药典都对注射液中不溶性微粒的检测做了严格的规定,包括美国USP788和USP787,中国CP0903,欧洲EP 2.9.19,以及日本JP和韩国KP,都对其中10μm和25μm以上的颗粒数做了严格的限制。

需要特别指出的是,眼科溶液的不溶性微粒检查在USP789中更加严格,不仅对大于10μm和25μm的颗粒数有更低限制的规定,而且还对大于50μm的颗粒数有要求。

目前中国药典推荐采用光阻法及显微计数法对不溶性微粒进行检测。贝克曼库尔特 HIAC 9703+不溶性微粒检测仪,采用光阻法原理,满足多国药典对各类注射剂药物的测试要求,同时根据USP787和CP0903小体积测试规定,对于珍贵样品单次检测体积只需200μL,即单个样品体积不到1.5mL即可完成不溶性微粒的检测,在大大节省测试样本的同时保证了制剂的高质量品质。

HIAC 9703+ 不溶性微粒检测仪

随着制剂技术的快速发展,产生了很多新型制剂,如注射用乳剂、混悬剂等,这类样品的特殊性,不适合用光阻法进行不溶性微粒检测,可采用显微计数法进行检测。徕卡显微系统的DM4P 偏光显微镜使用透射正交偏光进行不溶性颗粒观察,药物颗粒呈亮白色,载玻片呈黑色,色差明显,可以消除分析过程中载玻片颜色对微粒识别的干扰。配合专业的清洁度检测的解决方案:scanning stage + LAS X navigator 可以快速自动检测出一定尺寸范围内的颗粒的数量。

DM4P 偏光显微镜

生物药物工艺流程的复杂性导致了工艺过程杂质的多样性,不同分析方法的应用推动了工艺流程的优化和药物使用的安全,同时临床上药物的不良反应,又对引起这些不良反应的相关杂质的深入研究起到了推动作用。丹纳赫生命科学的多方位杂质检测方案可以帮助更加深入理解生物药物工艺过程的改善。

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